• Naomi Watts : Betty Elms / Diane Selwyn
• Laura Harring: Rita / Camilla Rhodes brune
• Justin Theroux : Adam Kesher
• Ann Miller : Catherine « Coco » Lenoix
• Dan Hedaya : Vincenzo Castigliane
• Lori Heuring : Lorraine Kesher
• Angelo Badalamenti : Luigi Castigliane
• Brent Briscoe :Détective Neal Domgaard
• Robert Forster : Détective Harry McKnight
• Katharine Towne : Cynthia Jenzen
• Lee Grant : Louise Bonner
• Melissa George : Camilla Rhodes blonde, avocate de Clara

Avant même l'apparition du générique, le film débute par une scène onirique représentant des danseurs de jitterbug ; une femme, d'abord entourée d'un couple âgé, s'avance pour recevoir les applaudissements ; un lit et son occupant endormi sont montrés. Victime d’un accident de voiture, une mystérieuse femme aux cheveux noirs, amnésique et blessée, erre sur la sinueuse route de Mulholland Drive : elle se dirige vers Los Angeles. Les enquêteurs chargés de mener les recherches sur l'accident indiquent qu'ils suspectent qu'une femme se soit dirigée jusqu'à la ville. À l'aube, cette femme se glisse dans l'appartement qu'une femme rousse et plus âgée s'apprêtait à quitter. Dans un restaurant du nom de Winkies, un homme raconte à son ami le cauchemar qu'il a eu dans lequel il y avait un horrible personnage derrière le bâtiment. Quand ils examinent les lieux, le personnage apparaît et l'homme ayant fait le cauchemar s'évanouit d'effroi. Alors que la femme aux cheveux noirs dort, plusieurs appels téléphoniques énigmatiques concernant sa localisation sont passés.

Betty Elms débarque à l'aéroport de Los Angeles : cette jeune femme souhaitant devenir actrice est accompagnée par deux compagnons de voyage rencontrés fortuitement ; ce trio est celui aperçu à la fin de la séquence d'ouverture. Le couple de personnes âgées quitte le lieu dans une limousine aux vitres teintées, l'homme et la femme regardent droit devant eux et sourient sinistrement. Betty fait son arrivée à la villa Havenhurst où loge sa tante Ruth. Elle est accueillie par la propriétaire, Coco, qui lui ouvre l'appartement de sa tante, actrice partie en tournage. C'est dans cet appartement que la femme aux cheveux noirs s'est réfugiée après l'accident ; la découvrant, Betty suppose qu'elle s'y est installée avec l'accord de sa tante. Betty lui explique comme elle est heureuse de se retrouver « dans un vrai palais ». L'autre femme est confuse et, ne se souvenant plus de son véritable nom, choisit celui de « Rita » quand elle voit une affiche du film Gilda, dans lequel joue Rita Hayworth. Plus tard, Joe Messing, un tueur à gages incompétent s'empare d'un carnet rempli de numéros de téléphone dans un bureau non déterminé et laisse trois victimes derrière lui.

Des hommes s'apparentant à des gangsters s'approprient le film d'un réalisateur hollywoodien du nom d'Adam Kesher : ils insistent pour qu'Adam embauche une actrice inconnue appelée Camilla Rhodes pour tenir le rôle-titre du film. Le réalisateur refuse et, après avoir quitté la salle de réunion, fracasse le véhicule des gangsters avec un club de golf puis s'enfuit. Alors qu'il est au volant, il reçoit un appel de sa secrétaire qui l'informe que Ray, son directeur de production, a licencié toute son équipe. Elle le supplie de se rendre au bureau pour régler la situation mais Adam préfère finalement rentrer chez lui. Une fois arrivé, il découvre que sa femme entretient une liaison avec un certain Gene. Sous le coup de la colère, il s'empare d'un pot de peinture rose et le verse sur les bijoux de sa femme ; il la plaque au mur après qu'elle a commencé à le frapper. Gene s'interpose et le jette hors de sa maison. Retranché à l'hôtel, Adam apprend peu après que sa banque a fermé son compte et qu'il est par conséquent ruiné. Sur conseil de son agent, il accepte de rencontrer un mystérieux personnage appelé Le Cowboy : celui-ci l'exhorte à embaucher Camilla Rhodes pour son propre bien.

Pour aider Rita à recouvrer la mémoire, Betty lui suggère de fouiller dans son sac à main : elles y trouvent une somme d'argent conséquente et une étrange clef bleue. Afin d'en savoir plus sur l'accident de Rita, elles se rendent au restaurant Winkies où une serveuse du nom de Diane prend en charge leur commande ; cela déclenche chez Rita le souvenir du nom de « Diane Selwyn ». Après une recherche dans l'annuaire téléphonique, elles appellent la seule femme qui porte ce nom mais personne ne décroche. Betty se rend alors à une audition que Rita l'a aidée à préparer : sa prestation y est encensée. Un agent l'emmène voir le plateau du film que réalise Adam : L'histoire de Sylvia North. C'est au tour de Camilla Rhodes de passer l'audition pour le rôle-titre du film, Adam annonce : « C'est la fille. » Presque immédiatement après avoir engagé Camilla, Adam se retourne et regarde fixement Betty. Celle-ci s'enfuit avant de rencontrer Adam en expliquant qu'elle avait promis de retrouver quelqu'un.

Betty et Rita, après avoir frappé à la porte de l'appartement de Diane Selwyn sans succès, y pénètrent par une fenêtre qui n'était pas verrouillée. Dans la chambre, elles découvrent le cadavre d'une femme morte depuis plusieurs jours. Terrifiées, elles retournent à la villa et Betty coiffe Rita d'une perruque blonde. Cette nuit-là, les deux femmes deviennent amantes ; Betty dit à Rita qu'elle l'aime. Rita réveille Betty à deux heures du matin et insiste pour qu'elles se rendent à une salle de spectacle à l’atmosphère inquiétante du nom de Club Silencio. Sur scène, un homme explique en espagnol et en français que tout n'est qu'illusion. Son spectacle est suivi de celui d'une femme richement maquillée qui chante le titre Crying de Roy Orbison en espagnol et a capella. Même si celle-ci semblait se dédier entièrement à sa prestation, elle s'évanouit mais le chant se poursuit : il s'agissait de playback. Betty ouvre son sac à main et en sort une boîte bleue dont la serrure semble correspondre à la clef de Rita. De retour à l'appartement, Rita retrouve la clef mais se rend compte que Betty a disparu. Elle se décide à déverrouiller la boîte : celle-ci tombe à terre. La femme plus âgée aux cheveux roux cherche la provenance du bruit qu'elle semble avoir entendue mais elle ne trouve rien.

Le Cowboy se montre à la porte de la chambre de Diane Selwyn et dit : « Salut, la belle. Debout là-dedans, c'est l'heure. » Diane Selwyn se réveille dans son lit. Elle a exactement la même apparence que Betty mais elle est dépeinte comme une actrice ratée plongée dans une intense dépression en raison d'un amour non partagé envers Camilla Rhodes. Invitée par Camilla, Diane se rend à une fête organisée chez Adam, sur Mulholland Drive. La limousine qui la conduit s'arrête avant d'atteindre la maison mais Camilla lui fait emprunter un raccourci à travers le jardin. Adam semble amoureux de Camilla. Au cours du repas, Diane explique qu'elle est venue à Hollywood après le décès de sa tante qui y travaillait ; elle dit aussi avoir rencontré Camilla lors d'une audition pour L'histoire de Sylvia North dont le réalisateur est Bob Brooker. Une autre femme embrasse Camilla : toutes deux se retournent vers Diane et lui sourient. Adam et Camilla s'apprêtent à faire une annonce importante, leur mariage, mais ils n'y parviennent pas et s'éparpillent en rires et baisers ; Diane les observe en pleurant.

Diane rencontre le tueur à gages au restaurant Winkies : elle lui donne une photo grand format de Camilla et une forte somme d'argent. La serveuse qui s'occupe d'eux porte un badge au nom de Betty. Le tueur à gages explique à Diane que quand le travail sera fait, elle trouvera une clef bleue. Diane lui demande ce qu'ouvrirait cette clef, le tueur à gages éclate de rire. En levant les yeux, Diane remarque l'homme qui avait fait le cauchemar : il se tient debout au comptoir. Derrière le restaurant, un sans-abri, qui est peut-être aussi le personnage monstrueux qui avait fait s'évanouir de peur cet homme au début du film, est montré en possession de la boîte bleue. La clef bleue posée sur la table en face d'elle, Diane est terrorisée par des hallucinations représentant le couple de personnes âgées. Elle court jusque son lit en hurlant et se tire une balle dans la tête. Le visage du sans-abri appairait alors dans la chambre. Dans la scène finale, une femme auparavant aperçue au club murmure « Silencio ».

c'est une plongée vertigineuse dans l'univers d'Hollywood avec plusieurs lectures possibles, rêve, fantasmes, ou retour arrière avec exploration du passé de Rita la brune amnésique. Ou alors sorte de retour vers le futur entre un avenir désiré par Betty la blonde et la réalité tragique. Des thèmes connexes: influence de la mafia sur le milieu du cinéma et homosexualité féminine. Extraordinaire, complexe, à voir et revoir pour tenter d'entrer dans le monde de Lynch.

Un délicieux vertige saisit le spectateur, conscient d'être manipulé et heureux de l'être. Une séquence encore plus mystérieuse, semble proposer sinon une explication, plutôt une direction de réflexion. Rita et Betty, mues par une force obscure, sont entrées dans une sorte de music-hall, presque vide, où se déroule un étrange spectacle. Sur scène il n'y a pas d'orchestre, mais on en entend un, très présent. Une chanteuse s'avance. Sa voix est magnifique; paroles et musique déchirantes. Betty et Rita fondent en larmes. La femme s'écroule, on la traîne en coulisses, mais elle chante toujours. Dans une loge, une spectatrice enturbannée, au port altier, contemple la scène, impassible. Toute la séquence est placée sous le double signe de l'illusion, qui gomme les frontières entre le vrai et le faux, le rêve et la réalité, et de la manipulation